Identificación de cianobacterias y optimización de su cultivo para restaurar la biocostra en suelos semiáridos degradados

Las tierras secas, que representan más del 40% de la superficie de la Tierra, son sistemas terrestres críticos debido a su baja disponibilidad de agua (Pravalie 2016). El cambio climático y la intensificación del uso del suelo están provocando la degradación de 12 millones de hectáreas de tierras secas al año (Brauch & Spring 2009), por lo que es urgente restaurarlas. Sin embargo, las estrategias de restauración tradicionales, basadas en el establecimiento de una cubierta vegetal, suelen fracasar por las condiciones ambientales tan extremas. Por lo tanto, son necesarias alternativas más viables.
Una de las comunidades clave, que se ven afectadas por la degradación de las tierras secas, son las biocostras. Están compuestas por distintos organismos, como líquenes, briófitos, microalgas, cianobacterias, hongos y bacterias heterótrofas, los cuales colonizan el primer centímetro de la superficie del suelo en los espacios entre plantas (Belnap et al. 2016). Un descenso de la cobertura de las biocostras (Rodríguez-Caballero et al. 2018) podría modificar el balance de agua (Chamizo et al. 2016), los ciclos biogeoquímicos (Elbert et al. 2012) y reducir la estabilidad y fertilidad del suelo (Beraldi-Campesi et al. 2009; Rodríguez-Caballero et al. 2012). Durante las últimas décadas, se han desarrollado nuevas técnicas para acelerar su recuperación natural o inducir la formación de biocostras artificiales (Weber et al. 2016; Zhao et al. 2016). Una de ellas consiste en inocular suelos con cianobacterias (Rossi et al. 2017), ya que éstas tienen una alta capacidad de adaptación a ambientes extremos. Estas bacterias fotoautótrofas fijan CO2, y algunas también N2, mejorando la fertilidad del suelo (Belnap 2003) y excretan exopolisacáridos que promueven la estabilidad del suelo y reducen la pérdida de humedad (Rossi & De Philippis 2015). Además, algunas cianobacterias producen escitonemina, un pigmento fotoprotector contra la radiación UV (García-Pichel & Castenholz 1991). Así mismo, su metabolismo está activo sólo cuando hay agua disponible, permaneciendo en un estado latente en momentos de sequía (Rajeev et al. 2013). También establecen relaciones de sintropía y competencia con otros organismos, como las bacterias heterótrofas, lo que influye en la comunidad microbiana del suelo (Baran et al. 2015; Maier et al. 2018). Por último, las cianobacterias facilitan la sucesión de organismos más desarrollados, como líquenes o musgos (Weber et al. 2016).
El primer paso en el proceso de inoculación es la selección de la cepa de cianobacteria a inocular, en consorcio o individualmente. Es preferible que sean nativas y, por tanto, han de ser aisladas de biocostras de los suelos a restaurar, para evitar la introducción de especies nuevas en el ecosistema y emplear cepas adaptadas a esas condiciones ambientales concretas (Giraldo-Silva et al. 2019). En los últimos años, se han publicado muchos análisis de la composición de comunidades de cianobacterias en biocostras (Williams et al. 2016; Chilton et al. 2017; Mogul et al. 2017; Muñoz-Martín et al. 2019), que han aportado información útil para la selección de cepas adecuadas para la restauración del suelo. Otro factor a tener en cuenta para la selección es su viabilidad para ser aisladas y cultivadas en condiciones de laboratorio, así como para la producción eficiente de biomasa. Finalmente, las características ecofisiológicas de cada especie deberían tenerse también en cuenta, como su capacidad para producir compuestos clave, por ejemplo, escitonemina o exopolisacáridos, o para fijar nitrógeno. Una vez que las cepas de cianobacterias han sido seleccionadas, se ha de producir la biomasa necesaria para inocular los suelos. La inoculación de áreas grandes conlleva la optimización de la producción de biomasa con el objetivo de desarrollar un método sostenible y eficiente. A pesar de que ya se han conseguido varias mejoras, como el uso de luz solar o aguas residuales, en lugar de agua dulce, para producir el medio de cultivo (Rossi et al. 2017; Wu et al. 2018), se precisan más esfuerzos para reducir el coste e incrementar la eficiencia del proceso de producción.
El siguiente paso es la inoculación del suelo con cianobacterias para inducir la formación de biocostra artificial. Existen varios estudios de inoculación de suelos, la mayoría de ellos desarrollados en laboratorios o invernaderos e incluso unos pocos en condiciones de campo (ej. Chen et al. 2006; Wang et al. 2009; Wu et al. 2013). Se ha demostrado que diferentes cepas de cianobacterias, como Microcoleus spp., Phormidium spp., Nostoc spp. o Scytonema spp., fueron capaces de colonizar con éxito distintos tipos de suelo (Hu et al. 2002; Román et al. 2018; Chamizo et al. 2018). También se ha probado que mejoraron varias funciones del suelo, como su fertilidad (Muñoz-Rojas et al. 2018), estabilidad (Mugnai et al. 2018) o disminución en la erosión hídrica y eólica (McKenna Neuman et al. 1996). Por otro lado, la mayoría de los esfuerzos para evaluar el éxito de la inoculación se han concentrado en el análisis de la influencia de factores abióticos como el riego o la incorporación de fertilizantes (Maestre et al. 2006), mientras que el efecto de los factores bióticos apenas se ha estudiado.
El objetivo principal de esta tesis es identificar especies de cianobacterias comunes en suelos áridos, así como optimizar su cultivo en laboratorio, para su uso como bio-inóculos con el fin de restaurar suelos semiáridos degradados. Para conseguirlo, se han abordado los pasos claves del proceso: comenzamos identificando, mediante el método polifásico, cepas de cianobacterias de biocostras en tres sitios de estudio con distintos niveles de degradación del sudeste de España: una cantera caliza (Gádor), un sistema de badlands (El Cautivo, desierto de Tabernas) y un matorral degradado (Las Amoladeras, Parque Natural Cabo de Gata-Níjar). Además, se analizó la composición de la comunidad de cianobacterias mediante la secuenciación del gen 16S del ARNr del ADN total de biocostras localizadas en sitios con distinto grado de conservación para apoyar la selección de la cepa a inocular. Se seleccionó una cianobacteria filamentosa y heterocistosa, Nostoc commune, por su presencia en todos los sitios de estudio, capacidad para fijar N2 y viabilidad para ser cultivada en condiciones de laboratorio. El siguiente paso consistió en optimizar la producción de biomasa de dicha especie mediante el uso de medios de cultivo más baratos hechos con fertilizantes, en lugar del uso de medios tradicionales más caros, obtenidos a partir de reactivos químicos. La biomasa producida fue inoculada en el mismo tipo de suelo del que fue aislada la cepa para determinar su efecto en las propiedades del suelo. Finalmente, la presencia o ausencia de la comunidad indígena del suelo y su interacción con la cianobacteria inoculada, fue analizada mediante la inoculación de la misma cepa sobre suelos esterilizados y no esterilizados, caracterizados por tener distintos niveles de degradación. Este factor biótico nos permitió evaluar la influencia de la comunidad indígena del suelo en el éxito de la inoculación, lo que es de interés para determinar el éxito de esta técnica en condiciones de campo.
Los resultados de la tesis muestran los tres grupos principales de cianobacterias que pudieron ser aislados e identificados de biocostras del sudeste español: las cianobacterias filamentosas no heterocistosas (Leptolyngbya frigida y Oculatella kazantipica), las que tienen varios tricomas en una misma vaina (Microcoleus steenstrupii, Trichocoleus desertorum y Schizothrix cf. calcicola) y las heterocistosas (Nostoc commune, Scytonema hyalinum y Tolypothrix distorta) (CAPÍTULO I). Las especies dominantes en las biocostras localizadas en los sitios con menor grado de conservación fueron Leptolyngbya frigida y Trichocoleus desertorum, lo que sugiere que podrían estar mejor adaptadas a condiciones más altas de estrés y, por tanto, podrían ser buenas candidatas para la inoculación de suelos en condiciones extremas. Además, otras posibles candidatas, debido al aumento significativo de su abundancia a medida que el grado de conservación disminuyó, fueron Leptolyngbya sp., Scytonema sp., Tolypothrix distorta y Nostoc commune. Por otro lado, el análisis de la composición de la comunidad de cianobacterias de biocostras mostró que las unicelulares/coloniales eran también abundantes pero difíciles de aislar. Estos análisis también mostraron que la riqueza específica de cianobacterias disminuyó y su composición cambió conforme aumentaba la degradación del suelo (CAPÍTULO II). Debido a su rápido crecimiento, tolerancia al estrés hídrico, elevada secreción de exopolisacáridos y capacidad para fijar nitrógeno, Nostoc commune fue seleccionada para llevar a cabo los experimentos de inoculación en laboratorio. En primer lugar, se optimizó la producción de esta cepa para futuras restauraciones a gran escala y se obtuvo un modelo de crecimiento mediante el uso de medio de cultivo hecho con fertilizantes agrícolas en lugar de compuestos químicos, disminuyendo así el coste del medio en 295 € ha-1. La inoculación de la biomasa obtenida mostró que cuando N. commune fue producido en el medio con fertilizantes, promovió mejoras más significativas en las propiedades del suelo, como incrementos en el contenido en carbono orgánico y exopolisacáridos del suelo de 8.9 g kg-1 y 2.2 mg g-1, respectivamente, y condujo al valor más bajo de albedo (17.6%), lo que reflejaba una mayor colonización. Además, la inoculación por separado de N. commune y del medio con fertilizantes sobrante después de recolectar la biomasa, demostró que el medio solo no produjo cambios significativos en las propiedades del suelo, pero contribuyó al rendimiento de la cianobacteria cuando se inocularon juntos (CAPÍTULO III). Finalmente, la inoculación de esta cepa tuvo éxito tanto en ausencia como presencia de la comunidad indígena de dos tipos de suelo, sin verse afectada por distintas frecuencias de riego. Sin embargo, la interacción entre N. commune y la comunidad indígena del suelo fue diferente dependiendo de las características fisicoquímicas del suelo. En suelos menos degradados, la interacción modificó positivamente las propiedades del suelo, como el contenido en carbono orgánico y exopolisacáridos. Por otro lado, en suelos más degradados, la interacción entre los dos dio lugar a una menor cobertura de cianobacterias. En conclusión, esta cepa puede ser utilizada para inocular incluso suelos inertes, pero sería recomendable el análisis de la comunidad del suelo antes de inocular, para predecir mejor el efecto de la inoculación en el éxito de la restauración (CAPÍTULO IV).
En resumen, los descubrimientos de esta tesis implican un avance en nuestro conocimiento de las comunidades de cianobacterias del sudeste español y un uso óptimo de cepas clave para restaurar suelos degradados mediante su inoculación. En primer lugar, se han identificado las especies de cianobacterias que colonizan las biocostras de la región más árida de Europa, aportando información valiosa con relación a su morfología y distribución. Esto es de interés para ampliar nuestra comprensión de las dinámicas de sucesión de las biocostras de estas zonas y sus efectos en las funciones del suelo. Además, se ha secuenciado el gen 16S del rRNA de las cepas aisladas, aumentando así la información existente en las bases de datos genéticas públicas, lo que apoyará futuras identificaciones de cianobacterias. También se han analizado las comunidades de cianobacterias de biocostras en sitios con distinto nivel de degradación, contribuyendo a la identificación de especies que puedan ser más resistentes a la degradación y, por tanto, candidatas interesantes para ser utilizadas en la restauración de suelos degradados. Así mismo, en esta tesis se demuestra que es posible optimizar la producción de biomasa de cianobacterias usando medios elaborados a partir de fertilizantes agrícolas, lo que convierte la inoculación de suelos con cianobacterias en una estrategia más rentable y aplicable en ensayos de restauración a gran escala. Además, el éxito de la inoculación en laboratorio de suelos de regiones semiáridas del Mediterráneo, las cuales son muy vulnerables a la degradación, pone de manifiesto el potencial de la aplicación de esta técnica en estas zonas. Nuestros resultados muestran la capacidad de N. commune de mejorar las propiedades del suelo, especialmente el contenido en carbono orgánico, después de inocular distintos tipos de suelos con diferentes niveles de degradación. También revelan la importancia de analizar la comunidad indígena del suelo antes de inocular para planificar una restauración con éxito. Por último, los resultados de esta tesis sientan la base para aplicar este método de forma más exitosa y eficiente a escala de campo.